生物材料的治療和診斷應(yīng)用正在激增，包括用于直接治療藥物遞送的抗體和抗體藥物偶聯(lián)物，用于藥物遞送新基因療法的病毒，以及用于藥物遞送復(fù)雜治療信號劑的細(xì)胞外囊泡。值得注意的是，每一類材料都包含一個具有納米級尺寸的關(guān)鍵組件，在某些情況下包括運載工具本身，在許多情況下還包括不需要的聚集體。在所有的開發(fā)階段，對這些材料中所需的和假的納米顆粒成分進(jìn)行定量，對于正確評估有效性和確保產(chǎn)品安全性是至關(guān)重要的。因此，亞微米尺寸范圍內(nèi)生物納米顆粒的精確物理表征是給藥物遞送行業(yè)越來越重要的要求。

而生物納米顆粒的粒徑與濃度測量始終對設(shè)備的要求越來越高。

生物納米顆粒的精確測量

一般來說，隨著亞微米顆粒的尺寸減小，其測量信號降低到測量儀器的檢測極限，其精確測量變得越來越困難。雖然低溫透射電子顯微鏡(CryoTEM)仍然是確定納米顆粒尺寸的金標(biāo)準(zhǔn)，該技術(shù)的亞納米尺寸分辨率使它作為一種偶爾的分析工具非常強大，但這種技術(shù)的成本和速度慢使其不適合常規(guī)使用。歷史上，亞微米尺寸范圍內(nèi)較為常用的粒子測量技術(shù)是光學(xué)技術(shù)，如動態(tài)光散射(DLS)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和流式細(xì)胞術(shù)(FC)。

然而，生物納米顆粒有三個共同的特征，這使得它們非常難以使用光學(xué)技術(shù)進(jìn)行測量，主要是因為這些測量依賴于檢測從這些非常小的粒子中散射的光。

首先，散射光的強度顯著降低，與直徑的六次方相關(guān)。因此，100納米粒子的散射光比1µm粒子少100萬倍。這種依賴性，再加上光學(xué)傳感器有限的動態(tài)范圍，限制了可以在單個樣品中測量的實際尺寸范圍，并使小粒子的檢測更具挑戰(zhàn)性。

其次，大多數(shù)生物材料的物理組成導(dǎo)致產(chǎn)生的粒子折射率與周圍的介質(zhì)相似，通常是水介質(zhì)，在某些情況下，指數(shù)相差只有幾個百分點。散射光強度與這個指數(shù)差（也稱為對比度）成正比，因此可以導(dǎo)致信號再次減少10到100倍。低折射率對比度和小尺寸的結(jié)合顯著削弱了從生物納米粒子散射的光的強度，從而限制了光學(xué)測量技術(shù)對這些亞微米粒子的靈敏度。

最后，生物納米顆粒的復(fù)雜起源（例如，聚集過程或從細(xì)胞中脫落）產(chǎn)生了具有不同的材料組成和廣泛的顆粒尺寸的真實樣本。高度的多分散性在這些樣品地方重大負(fù)擔(dān)大小分辨率的情況下，測量散射光從單一粒子，并提出了一個不可逾越的障礙，執(zhí)行集成測量的所有粒子入射光路徑和不能容忍顯著的多分散性。

測量納米顆粒大小和濃度的非光學(xué)技術(shù)為這些光學(xué)技術(shù)提供了一種強有力的替代方法。最常見的是基于一種被稱為電阻脈沖傳感(RPS)的電學(xué)測量技術(shù)，在過去被稱為庫爾特原理，以該技術(shù)的發(fā)明者華萊士·庫爾特原理命名。

RPS是一種被證明的測量大顆粒(>1µm)大小和濃度的技術(shù)，幾十年來一直是全血細(xì)胞計數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。RPS非常適合用于生物納米顆粒的測量，原因有三：

1。檢測信號隨粒子體積呈線性關(guān)系，因此在單個樣本中可以測量的動態(tài)尺寸范圍要大得多。

2. RPS的測量與粒子的材料組成無關(guān)，因此不像光學(xué)技術(shù)那樣遭受靈敏度的損失。

3. 由于粒子在RPS中以高精度單獨測量，高多分散性不是一個重要的問題。可以直接在復(fù)雜的介質(zhì)中直接進(jìn)行顆粒測量，如血清、尿液和其他生物液體，這些液體的多分散性會混淆光散射技術(shù)。

那么，為什么RPS的使用在過去僅限于大粒子呢？RPS要求所有被測量的粒子都通過物理收縮進(jìn)行檢測，并且必須減少物理收縮的尺寸才能檢測到更小的粒子。現(xiàn)實世界的樣品包含的顆粒濃度大于納米顆粒測量所需的小收縮尺寸。因此，在簡單的RPS實現(xiàn)中，樣品中的大顆粒會導(dǎo)致收縮的頻繁阻塞，并禁止了該技術(shù)的實際應(yīng)用。

2009年，為了早期嘗試克服這一障礙，Izon科學(xué)公司（克賴斯特徹奇，新西蘭）開發(fā)了用于RPS測量的qNano。Izon的實現(xiàn)設(shè)置了可變形膜(“可調(diào)”RPS)的收縮，可以調(diào)整，允許阻塞在恢復(fù)測量之前通過。雖然該技術(shù)已被許多學(xué)術(shù)出版物引用，但它在需要高通量和交鑰匙操作的工業(yè)應(yīng)用中的部署受到了限制。

最近，Spectradyne將一種不同的RPS方法商業(yè)化，顯著提高了在工業(yè)環(huán)境下對真實樣品進(jìn)行常規(guī)納米顆粒分析技術(shù)的實用性。Spectradyne公司的nCS1儀器是RPS(MRPS)的微流控實現(xiàn)，利用半導(dǎo)體行業(yè)的制造技術(shù)，將一些流控特性納入一次性分析盒，允許納米顆粒分析，同時顯著減少堵塞事件。MRPS可以直接測量高度多分散的生物納米顆粒樣品，如蛋白質(zhì)聚集物、血清、尿液和細(xì)胞外囊泡的粗制劑，并正在被制藥行業(yè)的著名研究人員所采用。

不管儀器的基本工作原理如何，所有儀器最終都受到其固有靈敏度和噪聲的限制。但隨著生物納米顆粒的重要性在藥物輸送行業(yè)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)如美國FDA越來越認(rèn)識到使用一套完整的描述方法的重要性，由蘇珊·科什納，博士，在2012年的談話題為“監(jiān)管期望聚合和粒子的分析”，包括方法正交于傳統(tǒng)的光技術(shù)。MRPS代表了一種實用且易于使用的替代方案。

MRPS測量實例

下面給出了三個測量例子，說明了上述考慮在現(xiàn)實世界的給藥行業(yè)應(yīng)用中的重要性。首先，比較三種不同的粒子分析方法(NTA、CryoTEM和MRPS)對簡單的胞外囊泡制備進(jìn)行測量，以顯示使用正交測量技術(shù)的重要性。其次，用NTA和MRPS測量一個聚集的蛋白樣本，并說明了上述儀器的限制如何適用于不同類別的樣本。最后，利用一系列應(yīng)激蛋白樣本的測量來證明MRPS較小的顆粒檢測極限如何能夠更早地檢測蛋白質(zhì)聚集。

例1：除非仔細(xì)純化，否則細(xì)胞外囊泡(ev)樣品自然表現(xiàn)出顆粒濃度與顆粒大小的近似冪律分布。如此寬的粒徑分布提供了一個很好的機(jī)會來評估不同測量技術(shù)在相關(guān)樣品類型的綜合尺寸范圍內(nèi)的靈敏度。對于這個測量示例，我們使用MRPS、NTA和CryoTEM分析了來自人類無細(xì)胞尿液中的一個簡單的ev樣本（圖1）。

使用三種正交技術(shù)：MRPS、CryoTEM和NTA測量從人血清中分離的細(xì)胞外囊泡。與MRPS和金標(biāo)準(zhǔn)CryoTEM等正交技術(shù)相比，光學(xué)技術(shù)對小的、弱散射的生物納米顆粒的靈敏度損失變得很明顯。

MRPS顯示了濃度與顆粒大小的明顯冪律依賴性，并延伸到50nm，這是本測量中使用的分析盒的檢測極限。重要的是，MRPS的測量結(jié)果與CryoTEM的測量結(jié)果非常一致，這是測量這類樣品中顆粒大小和相對濃度的金標(biāo)準(zhǔn)。

NTA的測量結(jié)果突出了NTA技術(shù)在檢測這類樣品中的小顆粒方面的局限性。NTA明顯低估了較小顆粒的濃度，與CryoTEM的結(jié)果變得明顯，從200nm開始，在150nm以下顯著增加。NTA和CryoTEM之間的差異在150nm直徑以下擴(kuò)展到幾個數(shù)量級。

因此，研究人員在解釋這些NTA數(shù)據(jù)時必須小心，特別是結(jié)果的剖面似乎表明在150nm左右的尺寸分布中存在一個峰值，這并不是粒徑分布的真正特征。只有在使用MRPS或CryoTEM等正交方法進(jìn)行比較時，峰值才能被準(zhǔn)確地識別為測量技術(shù)的人工產(chǎn)物，如本例中所述。不幸的是，不準(zhǔn)確的基于光學(xué)的EV尺寸分布測量，如NTA測量，經(jīng)常出現(xiàn)在文獻(xiàn)中，通常沒有正交技術(shù)，如MRPS或CryoTEM支持。

例子2：蛋白質(zhì)聚集在聚集過程中，直徑為幾納米的蛋白質(zhì)單體聚集成二聚體、三聚體，然后聚集成更大的顆粒，直徑可達(dá)幾十微米。這個過程產(chǎn)生了一種含有顆粒的高度多分散的混合物跨越直徑和濃度的許多數(shù)量級，具有物料濃度與顆粒大小的近似冪律分布。

在這個具體的例子中，在5 mg/mL的磷酸鹽緩沖鹽中制備了一個專有的蛋白質(zhì)樣品，并在高溫下脅迫24小時以加速聚集過程。采用NTA和MRPS方法測量了樣品中的粒徑分布（圖2）。MRPS測量結(jié)果顯示了濃度對大小的預(yù)期冪律依賴性，并進(jìn)一步表明冪律依賴性延伸到至少60nm，這是用于該測量的分析盒檢測的小尺寸極限。

當(dāng)通過MRPS測量時，應(yīng)激樣品中的蛋白質(zhì)聚集物顯示了濃度與大小的預(yù)期冪律依賴性。NTA的靈敏度的大小范圍是明顯的，因為該方法低估了約150-450nm直徑以外的濃度。

在本例中也清楚地說明了光學(xué)技術(shù)的靈敏度限制。雖然NTA很容易檢測到樣品中約150-450nm之間的粒子，但在150nm以下，NTA報告的濃度急劇下降（注意縱軸上的對數(shù)尺度），可能由于這些較小的蛋白質(zhì)聚集物的散射強度降低。由于這種濃度與尺寸的明顯下降，數(shù)據(jù)可能被錯誤地解釋為尺寸分布的峰值。如果不使用MRPS等正交技術(shù)來驗證粒度分布的真實性質(zhì)，很多研究人員可能會被誤導(dǎo)。

例3：MRPS可以更早地檢測蛋白質(zhì)聚集精確測量較小的生物納米顆粒，如用MRPS獲得的納米顆粒，可以為真實的藥物藥物遞送應(yīng)用節(jié)省時間。在這個例子中，MRPS被用來量化應(yīng)激藥物配方中的蛋白質(zhì)聚集物。結(jié)果表明，通過檢測和分析較小顆粒的濃度，可以在過程中早期檢測到應(yīng)力誘導(dǎo)的聚集。

一種專有生物藥物制劑的等分物被強調(diào)，時間從0分鐘（對照）到60分鐘不等，隨后使用MRPS來量化每個樣本中的聚集物（圖3）。數(shù)據(jù)非常清楚地顯示了預(yù)期的趨勢：隨著施加于樣品的應(yīng)力量的增加，樣品中聚集物的濃度在所有顆粒大小中都在增加。

應(yīng)激樣品中的蛋白質(zhì)聚集顯示出隨著應(yīng)激的增加而濃度增加的預(yù)期趨勢。對三個粒徑子范圍的濃度測量（插圖）表明，通過定量較小的聚集體，可以更早地檢測到應(yīng)力對樣品的影響。

然而，重要的是，骨料濃度首先在小顆粒尺寸時增加，然后在大顆粒尺寸時增加。這種效應(yīng)在數(shù)據(jù)中很明顯，如圖3中的插圖所示。當(dāng)在r1到r3（分別為小顆粒到大）上測量濃度時，在第一個時間點，僅在10 min后，應(yīng)力對樣品的影響是明顯的。這種行為與預(yù)期是一致的，因為蛋白質(zhì)聚集必須在生長到大尺寸之前開始小，并為配方開發(fā)節(jié)省時間提供了重要的機(jī)會。

使用精確的方法來定量較小的納米顆粒，如MRPS，配方應(yīng)力測試可以在很小部分的時間內(nèi)進(jìn)行，使用光學(xué)技術(shù)缺乏足夠的靈敏度來檢測較小的、早期階段的聚集體。在工業(yè)環(huán)境中，在過程中更快地獲得數(shù)據(jù)可以顯著提高過程效率。

隨著納米級生物材料的治療和診斷應(yīng)用的激增，其準(zhǔn)確的定量變得越來越重要。這篇文章表明，雖然普遍存在的，光學(xué)方法的納米顆粒分析必須在了解其局限性的情況下使用，并且結(jié)論應(yīng)該得到正交測量技術(shù)的結(jié)果的支持。所引用的例子說明了由于光學(xué)技術(shù)的靈敏度限制所造成的人工制品可能會誤測復(fù)雜的生物納米顆粒樣品的真實組成。這些例子還表明，實用的技術(shù)，如MRPS，能夠精確地定量測量亞微米生物粒子，并在現(xiàn)實世界的制藥工業(yè)應(yīng)用中提供了大量節(jié)省時間和金錢的機(jī)會。